La prima edizione del Premio “Toni Tellatin”,
dedicato alla miglior tesi sulla sindrome di Cornelia de Lange
è stata vinta da:
dr.ssa Laura Rachele Bettini
Titolo della tesi:
Correlazione tra espressione dei geni alla base delle coesinopatie e fenotipo nella sindrome Cornelia de Lange:
focus sul sistema nervoso centrale ed ematopoietico
Tesi di Laurea di Laura Rachele Bettini
Relatore: Prof.ssa Lidia Larizza
Correlatore: Dr.ssa Valentina Massa
Universita’ degli Studi di Milano, Facolta’ di Medicina e Chirurgia
Anno Accademico: 2012-2013
Breve riassunto:
OBIETTIVI
La sindrome Cornelia de Lange (CdLS) è una sindrome plurimalformativa causata da mutazioni in etero- o emi- zigosi in geni che codificano per il complesso delle coesine e suoi regolatori.
Le coesine hanno due principali funzioni: il controllo della corretta separazione dei cromatidi fratelli durante i processi di divisione cellulare e la regolazione dell’espressione genica. Si pensa che quest’ultima funzione sia quella compromessa nei pazienti affetti da CdLS.
In letteratura non sono disponibili dati riguardo l’espressione genica delle coesine nell’organismo umano, ad eccezione di un’unica analisi di espressione di NIPBL durante lo sviluppo embrionale ottenuta mediante ibridazione in situ.
Scopo di questo lavoro è stata l’analisi dell’espressione dei geni delle coesine responsabili della sindrome di Cornelia de Lange nei tessuti umani adulti di tutti gli organi e in alcuni tessuti fetali, con l’obiettivo di valutare in quali tra i tessuti analizzati fossero espressi, analizzarne le differenze e correlare l’eterogeneità fenotipica tipica dei pazienti affetti da CdLS con i livelli di espressione genica. Inoltre, sono stati studiati in modo approfondito i sistemi e gli organi che evidenziavano un’elevata espressione genica delle coesine quali il sistema nervoso centrale (SNC) e quello ematopoietico.
METODI
Allo scopo di analizzare l’espressione di NIPBL, SMC1A, SMC3, RAD21 e HDAC8 in diversi tessuti umani sono state eseguite reazioni di RQ-PCR su cDNA sintetizzato da RNA derivato da una banca di tessuti umani e da RNA estratto da sangue periferico e midollo osseo di donatori sani.
Per studiare l’espressione delle coesine nelle sottopopolazioni midollare, è stata adottata la tecnica del cell sorting utilizzando cellule mononucleate di midollo osseo di controllo.
Considerati i risultati ottenuti dallo studio dell’espressione dei geni delle coesine nei diversi tessuti, in particolare nel cervelletto si è voluto verificare se vi fossero malformazioni presenti a carico del sistema nervoso centrale in pazienti con CdLS. Sono stati quindi ricercati dati di indagini neuroradiologiche di una coorte di 101 pazienti CdLS seguiti presso l’ambulatorio di genetica dell’Ospedale San Gerardo di Monza. Di questi 101 pazienti 62 sono stati sottoposti a indagini di imaging diagnostico per lo studio del SNC, in particolare RMN encefalo.
RISULTATI
Da una prima analisi si è evidenziato che i 5 geni testati sono espressi in tutti i 17 tessuti analizzati, ma con livelli di espressione diversi nei vari tessuti.
È stato osservato che l’espressione di NIPBL, SMC1A, SMC3, RAD21 e HDAC8 era elevata a livello di tutti i tessuti facenti parte del sistema ematopoietico/immunitario quali il sangue periferico, il midollo osseo, la milza, il timo e il fegato fetale.
I tre tessuti appartenenti al sistema nervoso centrale che sono stati testati
sono il cervello, il cervello fetale e il cervelletto: in tutti e tre è stata evidenziata espressione dei geni delle coesine seppur con differenze evidenti.
NIPBLè apparso avere una minima espressione a livello del cervello fetale e del cervello, mentre è espresso in maniera significativa nel cervelletto.
Lo studio delle sottopopolazioni midollari ha individuato una maggior espressione dei geni delle cosine a livello della popolazione staminale.
Da una preliminare valutazione delle indagini neuroradiologiche a nostra disposizione si evidenzia che nel 30,6% (19 su 62) dei pazienti sono state riscontrate anomalie a carico del SNC di entità diversa, una quota delle quali interessanti il cervelletto.
CONCLUSIONI e PROSPETTIVE FUTURE
In conclusione, dall’analisi dell’espressione dei geni mutati nella CdLS in un ampio spettro di tessuti umani sono derivati risultati concordi con le nostre aspettative (espressione ubiquitaria delle coesine) e con alcuni dati della letteratura (elevata espressione di questi geni nei tessuti ad alto indice proliferativo e ad elevato contenuto di staminali).
Inoltre, sono emersi degli aspetti in linea con quanto alcuni gruppi di ricerca recentemente hanno illustrato riguardo al rapporto fra coesine, sistema ematopoietico-immunitario e CdLS. Per validare ulteriormente i dati ottenuti dagli studi di espressione sul midollo osseo, milza e timo si prevede di ripetere il sorting cellulare su midollo osseo di altri pazienti controllo e, se possibile, anche su midollo osseo di pazienti affetti da CdLS, ampliando l’analisi anche ad altre popolazioni cellulari come i linfociti T e le cellule mieloidi. Sarebbe poi importante cercare conferma di dati recentemente pubblicati anche nei pazienti della coorte di riferimento, valutando la possibilità di eseguire lo studio delle sottopopolazioni linfocitarie e delle immunoglobuline, in modo da confermare un’eventuale compromissione immunitaria nei pazienti affetti.
In ultimo, da questo studio emerge un possibile rapporto tra coesine e cervelletto: a sostegno di questo dato vi sono i risultati ottenuti dagli studi sul modello zebrafish di CdLS. In questo lavoro l’analisi è stata eseguita su tessuto di cervelletto adulto; sarebbe utile, anche se di difficile attuazione, eseguire lo stesso tipo di analisi su tessuto cerebellare embrionale e fetale a diversi stati di sviluppo.
Si è poi accennato un primo tentativo di correlazione clinica tra i dati ottenuti dall’espressione genica nel cervelletto e il fenotipo della CdLS attraverso la valutazione dei referti delle indagini di imaging diagnostico dell’encefalo: i limiti di questo approccio derivano dal fatto che queste indagini non sono parte dell’ìter diagnostico tipico dei pazienti con CdLS e dal fatto che ad oggi la comunità scientifica non ha raggiunto accordo unanime sulla specificità e patogeneticità delle anomalie del cervelletto. Per queste ragioni sarebbe utile rivalutare le immagini cui corrispondono i referti di RMN dell’encefalo di pazienti con CdLS con gli specialisti neuroradiologi in modo da poter stadiare le diverse malformazioni e, ad esempio, definire i gradi di ipoplasia del cervelletto. Infine, sarebbero necessari nuovi studi che meglio chiarissero la presenza e la definizione di disturbi comportamentali dello spettro autistico nei pazienti affetti da CdLS per poter approfondire il noto, sebbene discusso, rapporto tra anomalie del cervelletto e disordini dello spettro autistico.
